基於微高光譜和微流控技術的水稻真菌孢子檢測

背景

水稻真菌病害多由真菌孢子引起，真菌孢子是一種小型無性繁殖體
，主要通過空氣傳播。分生孢子越多，傳播範圍越廣，尤其是稻瘟菌（Magnaporthe grisea）和稻綠核菌（Ustilaginoidea virens）。全(quan)球(qiu)每(mei)年(nian)由(you)稻(dao)瘟(wen)菌(jun)造(zao)成(cheng)的(de)水(shui)稻(dao)產(chan)量(liang)損(sun)失(shi)達(da)數(shu)億(yi)公(gong)斤(jin)。稻(dao)綠(lv)核(he)菌(jun)一(yi)旦(dan)侵(qin)入(ru)籽(zi)粒(li)，就(jiu)會(hui)直(zhi)接(jie)導(dao)致(zhi)水(shui)稻(dao)空(kong)粒(li)率(lv)和(he)癟(bie)粒(li)率(lv)的(de)增(zeng)加(jia)。因(yin)此(ci)
，了(le)解(jie)如(ru)何(he)在(zai)水(shui)稻(dao)真(zhen)菌(jun)孢(bao)子(zi)傳(chuan)播(bo)的(de)早(zao)期(qi)階(jie)段(duan)快(kuai)速(su)捕(bu)獲(huo)和(he)準(zhun)確(que)識(shi)別(bie)孢(bao)子(zi)，對(dui)於(yu)早(zao)期(qi)病(bing)害(hai)預(yu)測(ce)至(zhi)關(guan)重(zhong)要(yao)。

kongqichengfenfuza，weishengwuzhongleifanduo

，baozidengweishengwuxuanfuzaiqiliuzhong，chuyubuduanpengzhuanghejujidezhuangtai。yinci，congkongqizhongyouxiaofenlihebuhuobaozichengweibaozijiancedeshouyaowenti。yuchuantongdebaozibuhuofangfaxiangbi，weiliukongjishushiyizhongkuaisu
、高通量的檢測方法，可以實現自動化分析、集成化、小型化和低消耗。目前已在生物醫學、食品檢測和環境監測等領域大放異彩。

顯微高光譜成像技術結合了高光譜和顯微技術的優點。它可以在細胞水平上對微生物進行無創檢測
，具有快速、無損的優點。它不僅可以采集小目標的圖像
，還可以同時采集目標區域的光譜信息。目前已被用於開發真菌生長模擬模型

、花生黃曲黴素檢測等研究中。

yinci，benyanjiutichuleyizhongjiyuweigaoguangpuheweiliukongjishudeshuidaozhenjunbaozijiancefangfa。zhenduidaowenjunbaozihedaolvhejunbaozishejileweiliukongxinpian，shixinpiannenggoufenlikongqizhongdeqitakeli
，bingzaixiangyingfujiquyucaijizheliangzhongleixingdebaozi。jiehexianweigaoguangpuchengxiangjishuduibaozijinxingjiance

，binggenjubaozideguangputezhengjianlifenleimoxing，weishuidaozhenjunbaozidezaoqijiancetigonglexinfangfahexinsilu。

試驗設計

江蘇大學毛罕平教授團隊設計了如圖1a所(suo)示(shi)的(de)微(wei)流(liu)控(kong)芯(xin)片(pian)。該(gai)芯(xin)片(pian)可(ke)分(fen)為(wei)三(san)種(zhong)結(jie)構(gou)，每(mei)種(zhong)結(jie)構(gou)都(dou)有(you)相(xiang)應(ying)的(de)分(fen)離(li)通(tong)道(dao)和(he)富(fu)集(ji)區(qu)。一(yi)級(ji)結(jie)構(gou)設(she)計(ji)為(wei)雙(shuang)入(ru)口(kou)對(dui)稱(cheng)預(yu)處(chu)理(li)通(tong)道(dao)
，其(qi)中(zhong)空(kong)氣(qi)中(zhong)的(de)孢(bao)子(zi)首(shou)先(xian)通(tong)過(guo)入(ru)口(kou)進(jin)入(ru)一(yi)級(ji)結(jie)構(gou)

，然(ran)後(hou)通(tong)過(guo)鞘(qiao)狀(zhuang)流(liu)道(dao)。鞘(qiao)狀(zhuang)流(liu)道(dao)的(de)主(zhu)要(yao)功(gong)能(neng)是(shi)將(jiang)含(han)有(you)孢(bao)子(zi)的(de)氣(qi)流(liu)擠(ji)壓(ya)到(dao)微(wei)通(tong)道(dao)中(zhong)，保(bao)證(zheng)進(jin)入(ru)芯(xin)片(pian)的(de)孢(bao)子(zi)在(zai)微(wei)通(tong)道(dao)中(zhong)心(xin)形(xing)成(cheng)單(dan)一(yi)的(de)孢(bao)子(zi)流(liu)陣(zhen)列(lie)。在(zai)鞘(qiao)狀(zhuang)流(liu)道(dao)之(zhi)後(hou)增(zeng)加(jia)一(yi)個(ge)減(jian)速(su)通(tong)道(dao)，以(yi)減(jian)少(shao)附(fu)加(jia)慣(guan)性(xing)力(li)對(dui)孢(bao)子(zi)運(yun)動(dong)的(de)影(ying)響(xiang)。通(tong)道(dao)中(zhong)的(de)孢(bao)子(zi)在(zai)隨(sui)氣(qi)流(liu)移(yi)動(dong)時(shi)也(ye)受(shou)到(dao)慣(guan)性(xing)的(de)影(ying)響(xiang)。質(zhi)量(liang)和(he)尺(chi)寸(cun)較(jiao)小(xiao)的(de)孢(bao)子(zi)會(hui)隨(sui)著(zhe)氣(qi)流(liu)移(yi)動(dong)
，進(jin)入(ru)分(fen)離(li)通(tong)道(dao)，到(dao)達(da)結(jie)構(gou)的(de)下(xia)一(yi)層(ceng)進(jin)行(xing)分(fen)離(li)


；而質量和大小較大的孢子由於慣性會繼續向原來的方向移動，最終會衝進富集區。鞘流和分離通道的工作原理分別如圖1b

、c所示。

圖1 微流控芯片的二維結構（a）;鞘流工作原理示意圖（b）;分離通道工作原理示意圖（c）

後續對微流控芯片數值進行模擬分析。利用COMSOL Multiphysics 6.0duowulichangfangzhenruanjianduiweiliukongxinpiandeliuchanghebaoziyundongjinxingleshuzhimoni，duixinpiancanshujinxingleyanzhengheyouhua。weilehuodegenghaodemonijieguo，monizhongshiyong5µm顆粒來表征稻綠核菌孢子，12µm顆粒用來表征稻瘟菌孢子，25µm顆粒用來表征空氣中較大的雜質，2µm顆粒用來表征空氣中較小的雜質。

本研究采用江蘇雙利合譜公司生產的GaiaMicro係列顯微高光譜成像係統用於孢子高光譜影像的獲取。該係統主要由顯微鏡
、V10光柵器件、電荷耦合器件探測器、數據采集模塊和計算機組成。有效波長範圍為400-1000 nm
，光譜分辨率為2.8 nm，光譜采樣率為0.7 nm。通過計算每個感興趣區內所有像素的光譜反射率的平均值作為該孢子樣本的光譜數據。兩種孢子共獲得300個光譜數據。為避免信息的冗餘

，文中采用競爭自適應重加權抽樣（CARS）用於特征的優選，並使用支持向量機（SVM）和卷積神經網絡（CNN）構建*佳孢子分類模型。

結論

為了找到隱藏參數的*佳值，並確保每個富集區域具有最高的富集效率，采用不同範圍的值對隱藏參數進行模擬。發現當通道角θ2為45度、寬度W1和W2均為1800 μm時，顆粒富集效率最高。當W4為1000 μm
、W3/W4為1.2以及W6為500 μm、W5/W6為1.6時分別對12 μm和5 μm的顆粒富集效率最高。

圖2a-d為本研究設計的微流控芯片對不同粒徑顆粒富集效果的模擬。粒徑大於或等於18 µm的顆粒由於慣性作用會衝進富集區1a和1b
，粒徑小於18 µm的顆粒會隨著氣流進入二級結構
，粒徑在8 µm ~ 17 µm的顆粒會衝進富集區2。第三階段的分離和富集結構與第二階段相似，粒徑在4 μm ~ 7 μm之間的顆粒進入富集區3，粒徑小於4 μm的顆粒直接從出口排出。微流控芯片通道的速度分布圖如圖5e所示
，微流控芯片通道的壓力分布強度圖如圖5f所示。

圖2 富集區1a和1b為25 µm顆粒（a）;富集區2為12 µm顆粒（b）

；富集區3為5 µm顆粒（c）；從出口排出2 µm顆粒（d）；微流控芯片通道速度分布（e）
；微流控芯片壓力分布（d）

圖3為wei孢bao子zi富fu集ji實shi驗yan平ping台tai。將jiang製zhi備bei好hao的de孢bao子zi懸xuan浮fu液ye放fang置zhi在zai氣qi溶rong膠jiao發fa生sheng器qi中zhong，空kong氣qi經jing氣qi泵beng壓ya縮suo後hou送song入ru氣qi溶rong膠jiao發fa生sheng器qi，產chan生sheng生sheng物wu氣qi溶rong膠jiao流liu。氣qi溶rong膠jiao流liu進jin入ru擴kuo散san幹gan燥zao器qi以yi除chu去qu水shui分fen。烘hong幹gan機ji後hou連lian接jie流liu量liang計ji，將jiang流liu速su設she置zhi為wei12.5 mL/min，與芯片模擬中的數值相同。同時，每個鞘流口分別連接另一個微流量計，並設定鞘流口流量為2.5 mL/min。最後的氣溶膠流進入微流控芯片的通道以分離和富集孢子。打開氣泵2 min後，孢子富集實驗完成。富集完成後，用鑷子夾住PDMS膜，緩慢取出。去除PDMS層的微流控芯片放置在顯微鏡下進行直接觀察。

圖3 孢子富集實驗平台

圖4展示了富集區2和富集區3的(de)微(wei)高(gao)光(guang)譜(pu)影(ying)像(xiang)。可(ke)以(yi)發(fa)現(xian)仍(reng)有(you)少(shao)量(liang)極(ji)小(xiao)顆(ke)粒(li)附(fu)著(zhe)在(zai)稻(dao)瘟(wen)菌(jun)孢(bao)子(zi)上(shang)一(yi)起(qi)進(jin)入(ru)富(fu)集(ji)區(qu)，但(dan)本(ben)實(shi)驗(yan)平(ping)台(tai)已(yi)具(ju)有(you)良(liang)好(hao)的(de)淨(jing)化(hua)效(xiao)果(guo)。同(tong)時(shi)稻(dao)綠(lv)核(he)菌(jun)孢(bao)子(zi)在(zai)富(fu)集(ji)區(qu)分(fen)布(bu)較(jiao)為(wei)均(jun)勻(yun)。最(zui)終(zhong)，本(ben)研(yan)究(jiu)設(she)計(ji)的(de)微(wei)流(liu)控(kong)芯(xin)片(pian)對(dui)稻(dao)瘟(wen)菌(jun)孢(bao)子(zi)和(he)稻(dao)綠(lv)核(he)菌(jun)孢(bao)子(zi)的(de)實(shi)際(ji)富(fu)集(ji)效(xiao)率(lv)分(fen)別(bie)為(wei)82.67%和80.70%。

圖4 稻瘟菌孢子富集結果（a）

；稻綠核菌孢子富集結果（b）

本研究使用CARS算法進行特征優選（圖5）。隨著CARS算法迭代次數的增加，總體上保留的波段數量在不斷減少，但減少的速度由快變慢，這是由於CARS算法在特征波段篩選過程中從粗篩選到細篩選的變化。從RMSECV的變化趨勢可以看出，隨著樣本數量的增加
，RMSECV有減小的趨勢。當樣本數量為6個時，REMSECV最小，所選擇的特征子集*優。最終選取了34個特征波長
，占總波段的5.67%。

圖5 CARS特征篩選結果

表1和表2分別展示了不同模型的分類結果以及分類指標結果。以CARS篩選後的波段為變量的分類模型優於以全波段為變量的分類模型。通過比較CARS-SVM和CARS-CNN分類模型
，發現兩種模型對稻瘟菌孢子的分類結果相似。而CARS-CNN模型對於稻綠核菌孢子的分類結果中
，其二級指標中的準確率
、精確率、召回率和特異性分別為0.960、0.950、0.970和0.950，三級指標的F1得分為0.960，遠高於CARS-SVM分類模型。F1得分越接近1
，說明分類效果越好。因此，CARS-CNN分類模型在稻綠核菌孢子分類中更有優勢。

表1 不同模型的分類結果

表2 不同模型分類指標結果

作者信息

毛罕平
，博士
，江蘇大學農業工程學院教授，博士生導師。

主要研究方向：現代設施農業及環境自動控製技術、智能化農業裝備技術、生物信息探測與傳感技術
、移栽機械。

參考文獻：

Zhang, X.D., Song, H.J., Wang, Y.F., Hu, L., Wang, P., & Mao, H.P. (2023). Detection of Rice Fungal Spores Based on Micro- Hyperspectral and Microfluidic Techniques. Biosensors (Basel), 13.

https://www.mdpi.com/2079-6374/13/2/278